结直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，每年全球新增病例约100万，至少有50万患者因其死亡[1]。近年来，随着西妥昔单抗的问世，结直肠癌的靶向治疗取得了长足的进步。RAS和BRAF基因突变是相互独立的，两者任何一个蛋白发生突变都会导致RAS-RAF-MAPK信号通路的激活[2]，因此只有RAS和RAF基因野生型患者才对抗表皮因子生长受体（EGFR）单抗药物治疗有效，而突变型无效[3]。德国肿瘤医学协会（AIO）合作调查小组在2013年欧洲癌症大会首次公布FIRE-3研究的结果，对于结直肠癌患者，仅进行KRAS检测还不够，应同时检测NRAS。进行RAS突变检测是为结直肠癌患者选择最佳一线治疗方案的关键策略。另外一项对结直肠癌患者的研究证实，在KRAS基因野生型的状态下，BRAF基因野生型的患者使用西妥昔单抗＋FOLFIRI总生存期显著延长[4]。最新的美国国家癌症综合治疗联盟（NCCN）《结直肠癌临床实践指南》（V3.2014）明确指出，KRAS和NRAS双基因野生型患者可从EGFR抑制剂治疗中获益。我们采用双向直接测序法分别检测结直肠癌组织中KRAS、NRAS和BRAF基因突变情况，总结我国结直肠癌患者中这3种基因的突变率和分布特征，通过这3种基因的检测，将有助于选择出那些最有可能从西妥昔单抗治疗中获益的结直肠癌患者。

　　一、材料和方法

　　1.临床病例和标本类型：

　　收集2014年4月1日至8月1日期间广东省人民医院首诊的结直肠腺癌手术标本共200例，其中原发肿瘤195例（97.5%），远处转移肿瘤5例（2.5%）；转移灶包括肝、大网膜、胰腺、淋巴结、腹壁各1例；中位年龄61岁；男性109例（54.5%），女性91例（45.5%）。所有标本均按常规行中性甲醛固定、石蜡包埋、切片及HE染色，由病理医师复阅切片明确诊断，并确定有足够的肿瘤细胞再进行后续检测。

　　2.DNA提取：

　　采用Qiagen公司的DNA提取试剂盒提取组织DNA，常规切片10 μm厚5～10张，脱蜡、水化。最后一张4 μm厚，HE染色观察形态，其余用于下一步提取DNA；显微镜下观察HE切片，选取富于肿瘤细胞的区域，肿瘤细胞比例达到20%以上，尽量避开非肿瘤区、坏死出血区等。对应HE切片将肿瘤组织刮取于洁净的EP管内，按照试剂盒说明书提取甲醛固定石蜡包埋组织中的基因组DNA，测定提取样本DNA的纯度和浓度，A260/A280在1.7～2.0之间的样本为好。

　　3.PCR：

　　针对KRAS基因第2、3和4号外显子，NRAS基因第2、3和4号外显子及BRAF基因第15号外显子设计合成引物。分别为KRAS基因第2号外显子上游引物：5′-ATTACGATACACGTCTG-CAGTCAACTG-3′，下游引物：5′-CTGTATCAAAGA-ATGGTCCTGCACCAG-3′；KRAS基因第3号外显子上游引物：5′-GAAGTAAAAGGTGCACTGTAATAAT-3′，下游引物：5′-CAATTTAAACCCACCTATAA-TGGT-3′；KRAS基因第4号外显子上游引物：5′-TTGTGGACAGGTTTTGAAAGATA-3′，下游引物：5′-CATAACAGTTATGATTTTGCAGAAA-3′；NRAS基因第2号外显子上游引物：5′-TGTAGATGTGG-CTCGCCAAT-3′，下游引物：5′-TGATCCGACAAGT-GAGAGAC-3′；NRAS基因第3号外显子上游引物：5′-GGCAATAGCATTGCATTCCC-3′，下游引物：5′-TCCCTAGTGTGGTAACCTCA-3′；NRAS基因第4号外显子上游引物：5′-GCCCAGGCTAATCTCAA-ACTCC-3′，下游引物：5′-TCTTGCACAAATGCTG-AAAGCT-3′；BRAF基因第15号外显子上游引物：5′-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3′，下游引物：5′-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3′。反应条件：95 ℃预变性7 min，95 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共35循环，后72 ℃延伸10 min，置4 ℃保存。

　　4.测序分析：

　　PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，利用核酸外切酶Ⅰ和碱性磷酸酶去除引物和dNTP，反应体系为5 μL：核酸外切酶0.5 μL，碱性磷酸酶0.5 μL，PCR产物4 μL，反应条件：37 ℃ 1 h，80 ℃ 20 min。将纯化的PCR产物进行测序PCR，反应体系为20 μL：纯化好的DNA 1 μL，BigDye（2.5×）8 μL，引物（2 μmol/L）1 μL，去离子水10 μL。反应条件：96 ℃ 1 min，96 ℃变性10 s，50 ℃退火5 s，60 ℃延伸4 min，共25个循环，置4 ℃保存。测序产物经NaAc和乙醇纯化后，在ABI 3500Dx基因测序仪上进行双向测序，测序结果用相关分析软件进行分析。

　　二、结果

　　1.KRAS基因突变分析：

　　200例结直肠患者中有88例检测到KRAS基因突变，突变率为44%（88/200），共检测KRAS基因突变位点15种，其中双突变2种（表1）。突变主要位于第2号外显子，突变率为35%（70/200），其中以第2号外显子的第12和13密码子的突变最为多见（图1），在所有突变类型中GGT>GTT（p.G12V）发生率最高，占总突变的26.1%（23/88），其次GGT>GAT（p.G12D），占总突变的23.9%，第12位密码子的突变占总突变的64.8%；GGC>GAC（p.G13D），占总突变的12.5%，其余5种突变发生率较低。还发现罕见双突变2例，分别为第19和20位密码子TTG>TTT，ACG>TCG（p.L19F和p.T20S双突变），第12和13位密码子GGT>GTT，GGC>GAC（p.G12V和p.G13D双突变）。200例患者中检出KRAS基因第3号外显子突变有6例，突变率为3%（6/200），共发现2种突变类型（图1），分别为CAA>CAT（p.Q61H）和GCA>ACA（p.A59T）。KRAS基因第4号外显子突变有12例，突变率为6%（12/200），共发现3种突变类型（图1），分别为AAA>AAC（p.K117N）、GCA>ACA（p.A146T）和GCA>GTA（p.A146V）。

表1 200例结直肠癌中KRAS基因第2、3和4号外显子突变发生情况

图1 基因突变检测结果

　　2.NRAS基因突变分析：

　　200例患者中有4例检出NRAS基因突变，突变率为2%（4/200），共发现4种突变类型（图1），分别位于第2号外显子的第13位密码子GGT>CGT（p.G13R）；第3号外显子的第51位密码子TGT>TGG（p.C51W）；第3号外显子的第61位密码子CAA>AAA （p.Q61K）和CAA> CGA（p.Q61R）。第4号外显子未检到突变。

　　3.BRAF基因突变分析：

　　200例患者有10例检出BRAF基因突变，突变率为5%（10/200），突变类型均为第600位密码子GTG>GAG（p.V600E）。

　　三、讨论

　　结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，传统治疗以外科手术为主，辅以放、化疗，术后5年生存率仅为50%左右。近年来，对于晚期结直肠癌，分子靶向治疗发挥了很大的作用。EGFR是一种受体酪氨酸激酶，属于erbB家族，又被称为HER-1或ErbB-1。其通过与配体结合，激活细胞内信号转导途径，导致细胞增殖、分化和抑制细胞凋亡。许多肿瘤如肾细胞癌、胰腺癌、非小细胞肺癌及结直肠癌细胞表面EGFR呈过表达[5]。抗EGFR抗体西妥昔单抗和帕尼单抗通过阻止配体诱导的EGFR酪氨酸激酶活化，来抑制PI3K/AKT以及RAS/MAP2K（即MEK）/MAPK1/3（即ERK2/1）信号转导通路下游分子的激活，从而抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。尽管抗EGFR药物的靶点是EGFR，但EGFR自身并不是临床疗效很好的预测因子，而EGFR依赖的2条信号通路RAS-RAF-MAPK和PI3K-PTEN-AKT的分子变异对靶向药物疗效的预测可能更有指导意义[6]。因此检测RAS和RAF的基因状态对预测结直肠癌使用西妥昔单抗和帕尼单抗疗效具有指导意义。

　　西妥昔单抗在KRAS野生型结直肠癌治疗中的价值已被证实，但同时研究发现并非所有的KRAS野生型结直肠癌患者均对EGFR抑制剂有反应，部分KRAS野生型肿瘤对EGFR抑制剂耐药，检测EGFR信号通路中其他导致耐药的改变可能有助于筛选出对治疗反应最大的人群。NRAS基因与KRAS基因一样，均属于RAS蛋白家族的成员，且在EGFR信号转导通路及该通路下游其他蛋白的调节中亦具有重要作用。有文献报道，在结直肠癌患者中约30%～55%伴有KRAS基因突变，而且突变主要位于KRAS基因第2号外显子的第12和13位密码子[7]；NRAS突变（第2和3号外显子突变）在结直肠中则较少见，发生率约为1%～6%[8]。我们采用PCR后直接测序分析了200例结直肠患者石蜡标本中KRAS和NRAS基因突变特征，结果显示KRAS基因总突变率44%，第12和13位密码子的突变分别占总突变的64.8%和12.5%，这些结果都与文献报道相符。BRAF是RAF基因家族中的一员，大约6%～10%的结直肠中存在BRAF基因突变，其中V600E是最常见的突变类型，在所有BRAF突变中占近90%[9,10]。研究发现，KRAS和BRAF突变在结直肠中是相互排斥的[11]，大部分研究表明，在化疗抵抗的情况下，BRAF基因突变的结直肠患者对西妥昔单抗或帕尼单抗没有反应[12]，BRAF基因突变是西妥昔单抗疗效的独立预测因素[13]。Yuan等[14]综合分析认为，BRAF基因突变型是转移性结直肠患者接受抗EGFR单抗治疗无效的指标。与之相反，有研究发现BRAF基因突变与有否接受西妥昔单抗治疗的KRAS基因野生型患者的疗效无关，但是其预后不良的指标[15]。同时，PRIME实验回顾性分析发现，采用FOLFOX4方案的BRAF基因突变型患者的总体预后不良[16]。总之，BRAF基因突变是患者预后不良的指标。但有限的资料提示，结直肠患者存在BRAF基因V600E突变时，一线治疗进展后使用抗EGFR单抗治疗是无效的。我们还对这200例样本进行了BRAF基因第15号外显子的检测，结果显示BRAF基因总突变率5%，全部突变类型为p.V600E，结果与文献报道的基本相符。

　　2013年欧洲癌症大会上公布的FIRE-3最新数据，在既往仅检测KRAS基因突变热点第2号外显子的基础上，进一步检测了KRAS基因第3和4号外显子、NRAS基因第2～4号外显子突变，发现了16%的患者带有KRAS第2号外显子以外的突变。我们的结果显示，除去KRAS基因第2号外显子，KRAS基因第3和4号外显子、NRAS基因第2～4号外显子突变的突变率为11%，分析与FIRE-3公布的数据差异，可能与检测人种和标本数量有关。

　　目前有关基因突变检测的方法很多，比较常用的有直接测序法和荧光定量PCR法。直接测序法也是目前应用最多的方法，但由于其操作步骤多，检测周期较长和灵敏度低（20%～30%）等问题，特别是甲醛固定石蜡包埋标本DNA片段化、PCR困难的情况，技术要求高，越来越少的单位使用该方法应用于临床检测。对于甲醛固定石蜡包埋标本，科学的前处理是得到高质量DNA的前提，我们的经验是对标本的严格质量控制，手术标本离体后，切开固定，4%中性甲醛固定24 h，制成蜡块后，蜡块应保存于温度适宜、通风干燥的地方。直接测序法最关键的是PCR，引物特异性和产物长度是影响PCR成功的重要因素。我们采用PCR后酶消化的方法的进行产物纯化，比割胶纯化和过柱纯化操作简单，成本低，交叉污染机会低，用酶纯化的方法要求设计的引物特异性高。总之，直接测序法检测流程多，每一步都要严格质控才能得到理想的测序结果。

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　　本文来自中华病理学杂志， 2015,44（04）： 254-257. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0529-5807.2015.04.009